SDS-PAGEのサンプル調製

SDS-PAGEで分子量に依存したタンパク質の分離を行うために、SDSを含んだバッファーと混合する必要がある。

細胞のサンプル調製では、まず細胞を適切なバッファーで破砕してタンパク質を定量する。その後、SDS-sample bufferを加えて熱することで、SDSに包まれたタンパク質の溶液が完成する。サンプルバッファーには、比重を増加させるスクロースや還元剤であるメルカプトエタノール、目印となる色素（ブロモフェノールブルー）などが含まれている。匂いが強いので、換気の良い場所で実験を行う。

必要な器具

超音波破砕機 ※グラスビーズなど細胞を破砕しても良い。
ヒートブロック、湯浴など

必要な試薬

◯4x SDS-sample buffer
　 1M Tris-HCl (pH6.8)　　2.5 mL
    2-メルカプトエタノール　2 mL
    SDS                             0.8 g
    スクロース　　　　　　  2 g
    ブロモフェノールブルー  少量（耳かき一杯弱）
　 MillQ水で10 mLまでメスアップ
◯PBS-T(1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 81 mM Na2HPO4·12H2O, 14.7 mM KH2PO4, 0.05% Tween-20)
◯Complete mini
◯Pierce BCAタンパク質アッセイキット

細胞の破砕
細胞を500 μLのPBS-T with Complete miniに懸濁（Complete miniはプロテアーゼ阻害剤。10 mL程度のPBS-Tに１タブレットを砕いて一欠片加えて溶解させる）。
氷上でよく冷やしながら行う。
↓
超音波破砕機で細胞を破砕
VC-750（Sonics）Intensity 20~30% x 10~20 sec
↓ 氷上でよく冷やす。
↓
超音波で破砕
↓
氷上でよく冷やす。これを繰り返し、５〜６回行う。
↓
遠心分離(15,000 rpm x 5 min, 4℃)
↓
上清を氷上で冷やしておいたマイクロチューブに移す。

I). タンパク質定量 
当研究室ではBCA法を用いている。Bradford法だとタンパク質量と吸光度の相関が悪い気がする。
希釈した上清 40 μLとBCA溶液 800 μLを混合する。
※この混合比率はプロトコールとは異なる。
※上清の希釈率は細胞量による。
※同時にBSAの検量線を作る。
↓
37℃で30分間インキュベート
↓
OD562で吸光度を測定。タンパク質濃度を算出する。

II). タンパク質サンプルの調製
上清と4xSDS-sample bufferを1:1~3:1の比率で混合する。
↓
98℃で3~5分間インキュベート
↓
-30℃で保存。
I)で算出したタンパク質濃度を用いて、SDS-PAGEを行う。

※プロトコールにつきましては、必ず他の文献などもご確認ください。