mBioに論文アクセプト

昨日は大変嬉しいニュース。

D2片山くんと助教伊東くんの論文が、mBioという雑誌にアクセプトになった。

内容はプレスリリースなので、もう少しお待ちを。

この論文は、筆頭著者がD2片山くん、最終・責任著者が助教の伊東くんである。コンセプトがほぼ２人のアイデアであったので、このような形にした。

小山内は論文を添削するとともに、変異株とか相補株とか作っていた。。

それなりに時間はかかったけれど、特に何かに急いでいたわけでもない。片山くんはついこの間も筆頭論文を出していて、次の仕事もだいぶ仕上がってきている。そもそも修士課程でも論文を１報出している（全部筆頭著者）。

なので、博士論文の要件を満たせるかどうかというレベルではない。

また、助教の伊東くんも、今年の３月に学位を取って、助教１年目。なので、焦って論文をパブリッシュしなければいけない時期でもなかった。なので、じっくり論文を仕上げた形である。

論文アクセプトは本当に大変だけれど、これがないと科学の成果とは認めてもらえない。年単位の粘り強さが必要な作業。

いずれにしても、とてもめでたい。コロナも今下がってきているし、個人的には９月下旬にオミクロン対応ワクチンも打ったところなので、焼き肉のチャンスかもしれない。。

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転写因子の改変で光合成が変化。。

Genetic manipulation to overexpress rpaA altered photosynthetic electron transport in Synechocystis sp. PCC 6803.
Arisaka S, Sukigara H, Osanai T. J Biosci Bioeng. 2018 Aug;126(2):139-144. doi: 10.1016/j.jbiosc.2018.02.005.

またもやしばらくサボっていた論文アーカイブス（論文紹介）・・。書くのにエネルギーが必要なもので・・。久しぶりに書こう。

こちらはM2有坂さんの研究。

転写因子であるRpaAの過剰発現によるシアノバクテリアの光合成改変の論文。

RpaAという転写因子は、シアノバクテリアでは結構な有名タンパク質。シアノバクテリアでは、サーカディアンリズムを生み出す時計タンパク質KaiABCというものが知られている。このKaiABCが２４時間の概日リズムを生み出す。

この時計からのシグナルを受け取り、遺伝子の転写を制御するタンパク質がRpaAである。RpaAはレスポンスレギュレーターと呼ばれる転写因子の１つである。なので、時計関連の転写因子と言える。

また、時計だけでなく、光シグナルも伝達することが知られている。光合成生物に大事な時計と光に関与するとても大事なタンパク質である。

今回の論文では、このrpaAを単細胞性のシアノバクテリアであるシネコシティス細胞内で過剰発現（タンパク質量をふやすこと）させた。

そうすると、光合成に関連するパラメーターであるFv/Fm, Fv'/Fm', qP, ΦIIなどが減少することがわかった。すごくざっくり言うと、光化学系IIの活性が下がり、光合成電子伝達全体の活性が下がったと言える。

一方で、光合成の本体（PSII, PSI）の遺伝子発現を調べたところ、これらの遺伝子発現は変化しなかった。

ということで、どこが鍵となって光合成が変化したかはわかっていない。

その前の論文で、rpaA過剰発現によって糖やアミノ酸代謝が大きく変わることを明らかにしているので、そちらの影響が大きいのかもしれない。

なので、クリアなことは言えないが、光合成を変化させるということはできた。現在、世界中の研究者が光合成を改変しようとしている。しかし、光合成はあまりにも複雑なため、光合成活性を落とすことはできても、上げることはそう簡単にはできない。今回のような知見を地道に積み上げていくことで、いつの日か光合成の活性を自由に操作できるようなことができれば良いと考えている。

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転写制御因子のダブル改変でコハク酸を増やす。

Cluster-Level Relationships of Genes Involved in Carbon Metabolism in Synechocystis sp. PCC 6803: Development of a Novel Succinate-Producing Strain.
Takeya M, Iijima H, Sukigara H, Osanai T.
Plant Cell Physiol. 2018 Jan 1;59(1):72-81. doi: 10.1093/pcp/pcx162.

さぼりまくっていた論文アーカイブス・・。ということで、ひさしぶりに論文紹介。

こちらは、現在M2の竹屋くんが筆頭著者論文となったもの。ポスドク飯嶋さんのデータもたくさん含まれている。

わが環境バイオテクノロジー研究室が誇る天才、竹屋氏の論文である。。いや、一期生なんだけど、いきなりこういう学生がいて、着任から「なんだ、この大学・・・」と驚くばかりである。就職関連のことも含めるのでブログには書けないが、他にもすんごい学生たちがたくさんいる。

それはさておき、こちらの論文は、単細胞性シアノバクテリアであるシネコシスティスの遺伝子改変により、転写制御メカニズムを調べるとともに、コハク酸の増産を行ったものである。

これまでにいくつかの論文でコハク酸増産株（コハク酸生産量が増える株）を作ってきた。６つのコハク酸増産株における、糖代謝やコハク酸生産に関わる遺伝子の転写産物量の解析をしたものである。

遺伝子間の関係性を相関係数とクラスター解析というもので明らかにしている。よくわからなくても、かっこよさげな図ができることはわかる。。。

これは、例えばある遺伝子Aの転写が増えた時に、別の遺伝子Bの転写が増えることが多いか、減ることが多いか、それとも関係ないことが多いかを数値で表したものである。

遺伝子AとBが関係するかどうかの解析である。

これらを駆使してコハク酸増産株の共通パターンを見出したのち、SigE、Rre37という２つの転写制御因子を過剰発現して、コハク酸を増やした。

生産量としては、３日間４２０mg/L。これは生産効率としては、発表時シアノバクテリアの世界最高記録である。

と言っても、その少し後に、うちのALCAチームである神戸大学の蓮沼先生がさらに塗り替えた（同じ研究チームとしてやっているので、もちろんデータは知っていた）。

こんな難しそうなクラスター解析を、なんと学生が自分でやってしまった。僕はというと、「どうやってクラスター解析ってやるの？」と聞くレベルである笑。もう、先生ってそんなレベルである（←威張ることか笑）。。

ということで、Figureだけで２０個もある長編論文。もう一歩良いジャーナルでも良いと思ったのだけれど、最終的にはPCPにアクセプトされる（もちろんPCPも素晴らしいジャーナルです。。。）。論文の質にはわりと良いと思うので、ぜひご一読を。

乳酸脱水素酵素わかってるつもり？

"Substrate Specificity and Allosteric Regulation of a D-Lactate Dehydrogenase from a Unicellular Cyanobacterium are Altered by an Amino Acid Substitution."

Ito S, Takeya M, Osanai T.

Sci Rep. 2017 Nov 8;7(1):15052. doi: 10.1038/s41598-017-15341-5.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29118438

お待ちかねの論文紹介である（まさか論文紹介が少ないなんてコメントがくるなんて夢にも思わなかった・・・）。

こちらは現M1の伊東くんの仕事。B4の時に出版し、その結果、みごと学生顕彰優秀賞を獲得して卒業式で表彰された。昨年の竹屋くんに続く２年連続の快挙である。

この仕事は、シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC6803の乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase）の生化学解析である。

乳酸脱水素酵素はピルビン酸から乳酸を合成する酵素である。

乳酸は不斉炭素があるため、L-乳酸とD-乳酸がある（本当はL, Dは小型大文字というフォントを使う）。L-乳酸を作る乳酸脱水素酵素はLdh、D-乳酸を作る乳酸脱水素酵素はDdhと略される。

シアノバクテリアSynechocystisは、D乳酸を作る乳酸脱水素酵素はDdhを持っている。100%ビュアなD-乳酸を作る酵素である。この酵素の生化学解析を行ったのがこの論文である。

論文では、シアノバクテリアSynechocystisのDdh（SyDdh）を組換えタンパク質として大腸菌から抽出・精製し、活性を測定した。

至適温度や至適pHを決定し、Km値やkcat値などを決定した。

また、１４番目のグルタミン残基をグルタミン酸に変えることで、マグネシウムイオンによって活性化されるようになったり、２３４番目のセリン残基をグリシンに変えることで、本来の基質ではないオキサロ酢酸を基質とできる活性が向上した。

乳酸脱水素酵素という酵素は、いろいろな生き物で非常にたくさん研究されているクラシックで有名な酵素である。しかし、シアノバクテリアでは解析がなく、上記のように面白いアロステリック制御や基質特異性を有することが明らかになった。

この論文でもそうだが、酵素というのは１つのアミノ酸を変えるだけで性質がガラッと変わってしまうことがわかってきた。

とすると、アミノ酸配列がわかっているからといって、相同性のある酵素と同じだろうとは思ってはいけないことになる。

現在は、メタボロームや代謝モデリングなどが盛んである。

しかし、このような解析だけでなく、やはり１つ１つの酵素の生化学を行っていかなければ、本当の意味での代謝の理解ができないのではないだろうか。

明治大学に移ってから生化学グループを作って酵素の解析を進めているが、この論文の結果をみてもその思いを強くするばかりである。

カリウムでコハク酸増産！？

"Anionic metabolite biosynthesis enhanced by potassium under dark, anaerobic conditions in cyanobacteria."

Ueda S*, Kawamura Y*, Iijima H, Nakajima M, Shirai T, Okamoto M, Kondo A, Hirai MY, Osanai T.

Sci. Rep. 2016, 6:32354. *同等貢献

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27576448

一期生上田さん、川村さん（当時学部４年生、既卒）が筆頭著者となった論文である。二人とも既卒である。元気かな・・・

シアノバクテリアを用いたバイオコハク酸生産のプロジェクトを抱えて明治大学に着任。コハク酸生産は、環境バイオテクノロジー研究室のメインテーマの一つである。

遺伝子改変によるコハク酸増産を明らかにしたが、こちらは培養法によるコハク酸の増産方法である。

先行研究では、単細胞性シアノバクテリアであるシネコシスティスを、暗嫌気条件で培養すると細胞外にコハク酸が放出されることを発見した。この暗嫌気条件では、バッファーや培地を用いていたが、この培養を塩濃度を変えて行なってみた。

具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムを100 mM加えて発酵させてみたのである。お試し実験で、コハク酸が増えるとはあまり期待していなかった。

ところが、コハク酸量を測定したところ、カリウムを入れた時だけコハク酸の量が２倍くらい増加した。ナトリウムやカルシウム塩では増えなかった。

メタボローム解析を行ったところ、カリウム存在下で発酵させると、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸などの有機酸の細胞内濃度が増加することが明らかになった。つまり、カリウムによって、発酵条件（暗嫌気条件）で有機酸の生合成が促進されることがわかった。

カリウム添加に、これまで取れたコハク酸をよく作る株であるSigE過剰発現&ackA欠損株（通称1299E株）を組み合わせると、コハク酸生産量が野生株の約11倍の140 mg/Lに増加することが明らかになった。また、乳酸生産も46倍の
210~220 mg/Lに増大することが明らかになった。

なぜカリウムを入れると有機酸の生合成が促進されるのかはわかっていないが、陰イオン性の代謝産物が包括的に増えるため、細胞内の電荷のバランスを取っている可能性がある。

このように、培養条件と遺伝子改変を組み合わせて、シアノバクテリアのコハク酸生産を増大させる研究を行っている。

めちゃくちゃ大事な酵素、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ

"Allosteric Inhibition of Phosphoenolpyruvate Carboxylases is Determined by a Single Amino Acid Residue in Cyanobacteria."

Takeya M, Hirai MY, Osanai T.

Sci. Rep. 2017, 7:41080.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28117365

こちらも明治大学に来てからの新プロジェクトである。きちんとした生化学を始めた。一期生竹屋くんが筆頭著者となった論文である。

理化学研究所時代も植物の研究で生化学を行っていた。ところが、シアノバクテリアについては代謝の研究を行っていたものの、代謝酵素の生化学は行っていなかった。代謝を研究しているのに、生化学を行っていないことについては忸怩たるものがあった。

生化学を始めるにあたり、目をつけたのがホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PEPC）である。PEPCは、炭素代謝や植物生理学の授業なんかで出てくるかもしれない。生物学を専攻する大学生ならば、おそらく一度は習う酵素である。

PEPCがどこででてくるかというと、C4型植物である。植物や藻類は、大気中の二酸化炭素を固定することができる。この二酸化炭素の固定は、リブロース-1,5-ビスリン酸カルボキリラーゼ/オキシゲナーゼ、通称ルビスコによって行われる。これがC3型植物である。

ところが、トウモロコシやサトウキビなどは、C4型植物と呼ばれ、異なる二酸化炭素の固定を行う。このC4型植物では、ホスホエノールピルビン酸からオキサロ酢酸を合成する際に二酸化炭素を取り込む。この反応を触媒する酵素がPEPCである。

さらにこのPEPCは重要で、大腸菌や酵母などの従属栄養生物において、コハク酸を生産する時にはこのPEPCが律速酵素になることが多い。

二酸化炭素の固定に重要で、コハク酸の生合成の律速酵素であるPEPC。まさに環境バイオテクノロジー研究室のための酵素といっても過言ではない。

この論文では、まずGST融合タンパク質として、単細胞性シアノバクテリアSynechocystisのPEPC（SyPEPC）を精製して、生化学解析を行った。至適温度や至適pH、kcatやKm値を決定した。

PEPCは、一般的にアスパラギン酸やリンゴ酸で活性阻害を受ける。ところがSyPEPCは活性阻害を受けない。はじめは何か実験系がおかしいのかと議論していた。ところが、売られている植物や微生物のPEPCを購入して同様の実験を行ったところ、アスパラギン酸やリンゴ酸で活性阻害を受けることがわかった。すなわち、SyPEPCが特殊な酵素であることがわかったのである。

マルチプルアライメントによるPEPCの配列比較を行った怒ろ、954番目のグルタミン酸がSyPEPCに特異的であることがわかった。そこでこのSyPEPCの954番目のグルタミン酸を、他のシアノバクテリアで保存されているリジンに変えて、生化学解析を行った。その結果、変異型SyPEPCの活性が、アスパラギン酸やリジンで阻害されることがわかったのである。

今度は反対に、アナベナというシアノクバテリアのPEPCの同じアミノ酸残基をリジンからグルタミン酸にして、生化学解析を行った。その結果、アナベナの変異型PEPCはリンゴ酸で活性阻害を受けなくなったのである。一方、アスパラギン酸については変化がなかった。

この研究に関しては、私はあまり口出しをしていない。一期生である竹屋くんが自分で大事なアミノ酸残基を発見し、その重要性をシネコシスティスのみならずアナベナでも証明したのである。かなり見事な仕事であった。

正直、もっと良い雑誌に通ると思っていたのだが、Scientific Reportsに落ち着いた。研究の価値が下がるわけではないし、学部４年生でScientific Reportsに出版したのですごいことであるのだが、もう少し評価されてもいいなと思うのが本音である。

いずれにせよ、当研究室の生化学グループの最初の論文であり、生化学グループはこれから栄光の道を歩んでいく・・・。

ACR11は、シロイヌナズナの窒素同化酵素のアクチベーター

"ACR11 is an Activator of Plastid-Type Glutamine Synthetase GS2 in Arabidopsis thaliana."

Osanai T, Kuwahara A, Otsuki H, Saito K, Yokota Hirai M.

Plant Cell Physiol. 2017, 58:650-657.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28339983

こちらは、初めてのシロイヌナズナの論文である。

まずはじめに。

この論文１本出版するのに、全部で７〜８年間かかった。
もう、本当に・・・

内容はとても単純である。窒素同化でもっとも大事な酵素が何かと言えばグルタミンシンセターゼ（GS）である。この酵素は、グルタミン酸からグルタミンを作る際にアンモニアを取り込む。これによって、細胞内に窒素が供給されるのである。ほとんどの生物で、このグルタミンシンセターゼはもっとも重要な窒素同化酵素である。

シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）は言わずと知れた植物のモデル生物である。シロイヌナズナには、６つのGSがあり、GS1:1~1:5とGS2と名付けられている。GS1~6ではない。GS1:1~GS1:5は細胞質型、GS2は葉緑体型である（正確にはGS2はミトコンドリアにも移行する）。

本研究では、葉緑体型GS2の活性制御機構を調べた。GSは非常に重要な酵素であるため、転写から翻訳、タンパク質の修飾など、様々に制御されていることが、いろいろな生物で知られている。特にタンパク質-タンパク質間相互作用によって活性制御されている例が、幾つかの生物知られているが、GS2では知られていなかった。

本研究では、 共発現遺伝子データベースであるATTED-IIを用いて、GS2と関連のある遺伝子を探索した。その結果、ACR11という遺伝子がトップヒットであった。

ACR11は、ウリジリルトランスフェラーゼという酵素のホモログである。ウリジリルトランスフェラーゼとは何かというと、大腸菌でGSの活性を間接的ではあるが制御する因子であり、窒素のセンサーとして働いている。

ということで、どう考えてもACR11がGS2と関係がありそうだったのである。そこで、GS2とACR11をGSTやHisタグなどの融合タンパク質として精製した。そしてGS2の活性を調べたところ、ACR11によってGS2の活性が増加することがわかった。

また、窒素同化活性の低下のためか、ACR11欠損株は、生育が悪くなった。ACR11遺伝子の相補によって、生育が回復することもわかった。

さらに、ACR11欠損株では、アミノ酸の中で、グルタミンだけが野生株よりも減少していることが明らかになった。グルタミンはGS2の生成物である。

このように、本論文では、ACR11が窒素同化酵素GS2のアクチベーター（活性化因子）であることを明らかにした。すっきりとした結論の論文である。

当然良いジャーナルにと思ったのだが・・・なかなか通してもらえなかった。リバイスの要求がかなりつらく、できないものも多かった。理化学研究所から明治大学へ異動し、シロイヌナズナの実験もできず、また、自分自身で実験ができなくなってしまったことが本当に痛かったのである。このため、出版が2017年になってしまった。主要なデータは、2010~2011年くらいに取れていたのに、である。

いずれにせよ、内容は自信があるが、良いジャーナルにはならなかったという残念さが残ってしまった。異動や他のプロジェクトとの兼ね合いの難しさでなかなか手が回らなかったのである。

ともあれ、初めての高等植物の論文であり、ユーグレナに続いてシネコシスティス一辺倒から脱却できたことは嬉しい限りではある。

ユーグレナによるコハク酸生産

"Succinate and Lactate Production from Euglena gracilis during Dark, Anaerobic Conditions."

Tomita Y, Yoshioka K, Iijima H, Nakashima A, Iwata O, Suzuki K, Hasunuma T, Kondo A, Hirai MY, Osanai T.

Front. Microbiol. 2016, 7:2050.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28066371

これまで発表した論文は、すべてシアノバクテリア、しかも単細胞性非窒素固定型として世界中でモデル生物として使われているシネコシスティスが研究対象であった。この論文は私にとって、初めてのシアノバクテリア以外となる。

ユーグレナは別名ミドリムシと呼ばれている。小学生や中学生のころに池から採ってきて顕微鏡で覗いたことがあるかもしれない。直径が10~30マイクロメートルなので、光学顕微鏡で見ることができる生物である。

ユーグレナは藻類であるため、光合成を行うことができる。また、鞭毛によって水中を泳ぐこともできる。その進化は結構複雑で、何回かの共生を経て現在のユーグレナになったと言われている。

ユーグレナは、株式会社ユーグレナによって世間一般にも広く知れ渡るようになった。科学未来館で売られたミドリムシクッキーという１枚にユーグレナが数億匹？入ったクッキーが話題となった。その後、お菓子や飲料など、様々な商品にミドリムシが入り、広く一般にも販売されるようになっている。

このユーグレナは食品だけでなく、新しい展開も模索されている。ユーグレナを使ったワックスエステルという燃料物質の生産も計画されており、車や飛行機の燃料として使われることが期待されている。

そんな中、我々が発見したのは、ユーグレナがプラスチック原料であるコハク酸を生産するということである。

先行研究で、シアノバクテリアを暗・嫌気条件、すなわち発酵条件にするとコハク酸が細胞外に放出されることを発見した。そこで別の生物でも試してみようとしたのである。せっかくなら商業化されている生物ということで、ユーグレナを試してみた。

この研究は、株式会社ユーグレナとの共同研究であり、理化学研究所時代に始めたものである。たまたまユーグレナ社の研究所が理研の近く（横浜市鶴見区）に引っ越してきたので、「じゃあやってみましょう」という軽いノリで始めたものである。その時はこんなにうまくいくとは夢にも思っていなかった。

その結果、ユーグレナも同じく発酵条件でコハク酸を細胞外に放出することがわかった。特に、ユーグレナをあらかじめ窒素欠乏条件にした後に発酵させると、コハク酸生産量が劇的に増えることが明らかになった。

窒素欠乏条件ではパラミロンという炭素貯蔵源が増加し、発酵条件ではこのパラミロンを分解してコハク酸を作るため、このような効果が現れたのではないかと予想している。遺伝子組換えを行っていないユーグレナの生産量は800 mg/L以上となかなか高く、今後も期待が大きい。

ユーグレナがプラスチック原料を生産するということを発見し、これは新聞にも取り上げられ、反響もあった。シアノバクテリア以外の初めての論文ということもあり、私としても感慨深い論文の１つである。

ヒスチジンキナーゼによる光合成とアミノ酸代謝の改変

"Modification of photosynthetic electron transport and amino acid levels by overexpression of a circadian-related histidine kinase hik8 in Synechocystis sp. PCC 6803."

Kuwahara A*, Arisaka S*, Takeya M*, Iijima H, Hirai MY, Osanai T.

Front. Microbiol. 2015, 6:1150. *同等貢献

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26539179

この論文からいよいよ明治大学環境バイオテクノロジー研究室の学生が登場してくる。

このHik8は、シネココッカスSasAのホモログである。SasAは、概日リズム（サーカディアンリズム）を作る時計タンパク質であるKaiCに相互作用するヒスチジンキナーゼである。すなわち、時計の情報で伝達するヒスチジンキナーゼである。

シネコシスティスにおいて、Hik8もKaiCとin vivoで相互作用することから、時計の情報を伝達していると考えられるが、詳細は不明である。

前回の論文でHik8過剰発現株を作製し、糖やアミノ酸の代謝が変化することが分かった。代謝とサーカディアンリズムは密接な関係があるため、Hik8の遺伝子改変で代謝が変わることは予想できたことである（ただし、どのように変わるかはいまいち予測できない）。

ところで、サーカディアンリズムに従うのは代謝だけではない。光合成もサーカディアンリズムで変動する。

これはとてもわかりやすく、昼に光合成の遺伝子発現が増加し、夜に減少する。とてもシンプルだが必要な動きだろう。

ともなれば時計の情報を担うと考えられているHik8過剰発現株でも光合成が変化するはずである、というわかりやすい仮説を立て、検証したのが本論文である。

酸素電極やクロロフィル蛍光測定の結果、Hik8過剰発現株では、光合成や呼吸の活性に変化があるとが明らかになった。

光合成活性が増大すれば良かったが、残念ながら光合成活性は低下する傾向にあった。不思議な点であるが、光合成に関連する遺伝子発現は、むしろすべて増加していた。遺伝子発現が増加すれば光合成が強化されるわけではないという、光合成の難しさの一面も垣間見えた。

光合成の研究というのは非常に難しく、植物や藻類を扱っているからできるかというと、そういうわけではない。むしろ難しいので、多くの研究者が避ける分野なのである。

私も光合成の専門家ではないが、酸素電極や簡易的なクロロフィル蛍光測定を駆使して、光合成の解析を行いたいと考えている。

なぜなら、光合成は、地球上の生命を支えている最も重要な化学反応の１つだからである。

ところでHik8は概日リズムを伝えていると述べたが、そのほかにも光シグナルや栄養シグナルが時計には入力されていると考えらえている。このような時計タンパク質を中心としたシグナル伝達にも注目していきたいと考えている。

水素とコハク酸の関係、hoxH欠損によるコハク酸増産

"Metabolomics-based analysis revealing the alteration of primary carbon metabolism by the genetic manipulation of a hydrogenase HoxH in Synechocystis sp. PCC 6803."

H Iijima, T Shirai, M Okamoto, F Pinto, P Tamagnini, T Hasunuma, A Kondo, MY Hirai, T Osanai

Algal Research, 18:305-318.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211926416302247

こちらはコハク酸増産についての論文。単細胞性シアノバクテリアSynechocystisの話である。

コハク酸というバイオプラスチック原料が、暗・嫌気条件（すなわち発酵条件）でシネコシスティスの細胞外に放出されることが明らかになった。コハク酸量を増やす方法を探索するのが、当研究室のメインテーマの１つである。

暗・嫌気条件では、シネコシスティスは水素を生産することが知られている。水素は、次世代エネルギーとしても知られている物質である。過去には、RNAポリメラーゼシグマ因子SigEの過剰発現によって、水素の生産量を増加させるという論文も書いた。

コハク酸と水素はどちらも暗・嫌気条件で生産される。そして、どちらの物質も還元力（NAD(P)H）を生合成に必要とする。このことから、コハク酸生産と水素生産が競合している可能性が考えられた。そこで、水素生産を減少させれば、コハク酸生産が増えるのではないかと考えた。

シネコシスティスでは、水素はヒドロゲナーゼという酵素によって生産される。ヒドロゲナーゼはHoxEFHUYという５つのサブユニットからなることが知られている。このうち、活性に必須なHoxHの破壊株の作製を試みた。

しかし、完全破壊は致死的になるためか、hoxHの発現は完全にはなくならなかった。しかし、hoxHの発現が低下し、水素の生産量が低下したhoxH変異株が得られた。

このhoxH変異株を用いて、コハク酸などの有機酸の生産量を調べたところ、コハク酸と乳酸の量が増加し、酢酸の量が低下することが明らかになった。

コハク酸と乳酸の生合成は還元力NAD(P)Hを必要とするが、酢酸は必要としない。水素生産が低下することで還元力が余ったため、還元力を消費するコハク酸と乳酸の生産量が増加し、酢酸の生産量が低下したのだと考えられる。生物は本当によくできているものである。

また、hoxH変異株でトランスクリプトーム解析を行ったところ、糖異化遺伝子群の発現が増加していることがわかった。特にRNAポリメラーゼシグマ因子sigEの発現とSigEレギュロンの発現が増加していたことから、SigEのタンパク質量も調べたところ、hoxH変異によってSigEタンパク質量が増加することがわかった。SigEは糖異化を促進する因子であるので、このSigEタンパク質の増加も、コハク酸生産量が増加した一因の１つであると考えられる。

水素の合成酵素を改変するという少し変わった方法で、コハク酸の増産に成功したのである。

当該内容は、明治大学から特許出願も行っている。
http://www.conceptsengine.com/patent/application/2017070252

このように、環境バイオテクノロジー研究室では、バイオプラスチック原料などに関する特許出願や論文の発表を積極的に行っている。

シアノバクテリアのコハク酸生産という新しい分野

"Genetic manipulation of a metabolic enzyme and a transcriptional regulator increasing succinate excretion from unicellular cyanobacterium."

Osanai T, Shirai T, Iijima H, Nakaya Y, Okamoto M, Kondo A, Hirai MY.

Front. Microbiol. 2015, 6:1064.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=osanai+meiji

この論文は、現在の研究プロジェクトであるシアノバクテリアを用いたコハク酸生産の一番最初の論文である。自分の中ではかなり重要な論文である。

コハク酸は、クエン酸回路（TCA回路）の中間代謝産物であることは、生物学を学んだ人間ならばだれでも知っていることだろう。ところが、コハク酸がプラスチック原料となることはあまり知られていない。コハク酸は、1,4-ブタンジオールと反応して、ポリブチレンサクシネート（PBS）という汎用的に使われるプラスチック原料となる。このほか、食品添加物、入浴剤、可塑剤など幅広く使われる工業原料なのである。

石油から合成されるコハク酸であるが、現在バイオ由来のコハク酸生産が競争となっている。少なくとも４つのベンチャー企業が誕生し、年間数万トン規模でバイオコハク酸が生産されている。この時には酵母や大腸菌などの従属栄養生物が使われている。従属栄養生物がコハク酸を生産する場合には、糖を炭素源とする必要がある

我々は、従属栄養生物を使わずにシアノバクテリアを利用することで、糖ではなく大気中の二酸化炭素を出発原料とするコハク酸生産を目指している。

この論文によって、単細胞性シアノバクテリアであるシネコシスティスが、暗・嫌気培養することでコハク酸を細胞外に放出することを明らかにした。コハク酸だけでなく、酢酸や乳酸も細胞外に放出されることが明らかになった。

コハク酸の生産量を高めるために、副生成物の生産阻害を行ったところ、酢酸合成酵素遺伝子であるackAを欠損させることで、コハク酸量が増加した。

また、糖異化のグローバルレギュレーターであるRNAポリメラーゼシグマ因子SigEの過剰発現とackAの欠損を組み合わせることで、コハク酸が野生株の約５倍である70 mg/Lに増加した。

このように、酵素と転写制御因子という２つの遺伝子を改変することによって、シアノバクテリアのコハク酸の生産量を増大させることに成功した。そもそもシアノバクテリアの野生株が、嫌気条件でコハク酸を細胞外に放出することを示したのは、この論文が初めてである。

この研究を端緒として、現在も環境バイオテクノロジー研究室では、二酸化炭素（CO2）からのバイオコハク酸生産の研究を進めている。主要な研究テーマの一つである。

まだまだ生産効率が悪く、実用化にはほど遠いのであるが、二酸化炭素からのものづくりは企業から求められていることであるので、斬新な方法をたくさん開発し、社会実装を行っていきたいと考えている。

転写因子RpaAによる代謝改変

"Changes in primary metabolism under light and dark conditions in response to overproduction of a response regulator RpaA in the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803."

Iijima H, Shirai T, Okamoto M, Kondo A, Hirai MY, Osanai T.

Front. Microbiol. 2015, 6:888.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26379657

こちらも新しい転写制御因子を使った代謝改変の論文。それにしてもこのころからいっぱい論文出しているなと感じる・・・たくさん出しているのだが、楽な論文はなく、毎回毎回大変なのだけれど、表にはあまり見えてこない。でも、必ずどの論文も大変です。そして、論文を書かないで優雅に研究をさせてもらえる時代でもないので・・・

時計関連のヒスチジンキナーゼHik8の過剰発現によって糖代謝やアミノ酸代謝を変えることができた。

Hik8は別のシアノバクテリアでSasAという名前がついている。このタンパク質は概日リズム(サーカディアンリズム)の情報を伝達する役割を持っている。

SasAはヒスチジンキナーゼであるため、下流にレンポンスレギュレーターがあり、リン酸リレーによってレスポンスレギュレーターの活性を制御し、細胞内の遺伝子発現を変化させる。

RpaAは、SasAの下流にあるレスポンスレギュレーターであることが知られている。シネココッカスというシアノバクテリアでは、このRpaAが概日リズムの情報に従って細胞の遺伝子発現を変化させる。

シネコシスティスの場合は、Hik8の下流にRpaAがあるかははっきりしていないが、光合成関連の遺伝子の発現を制御するため、概日リズムや光シグナルの伝達に関与し、類似の遺伝子発現制御を担うと考えられている。

この論文では、RpaA過剰発現株を作り、遺伝子発現や代謝変化を調べた。その結果、Hik8過剰発現株と類似の変化が起こったことから、シネコシスティスにおいてもHik8からのシグナル伝達の一部はRpaAによって行われていることが示唆された。特にHik8過剰発現株、RpaA過剰発現株共に、暗条件下で糖異化酵素関連遺伝子のmRNA量が多く、かつ、RNAポリメラーゼシグマ因子SigEのタンパク質量＆mRNA量が多かった。

このことから、暗条件下で働く糖異化は、Hik8&RpaAによってシグナルの一部が感知・伝達されていることが示唆された。

このほかにも、RpaA過剰発現株では暗条件下特異的にグリシンやリジンなどが増えることがわかった。

このように、時計関連の転写制御因子を改変すると代謝を変化させることが可能であることがわかってきた。しかし、同時に代謝を制御する転写制御因子は複雑であるため、なかなか思い通りの制御ができず、基礎研究を進めて全容を解明することが必要であることもわかってきた。

シアノバクテリアの時計タンパク質のメカニズムについてはものすごく研究されているけれど、シネコシスティスについては数が少ない。ただし、うちの研究室ではメカニズム解明よりは代謝工学に重点を置いて研究を進めている。

シアノバクテリアの海水培養に成功！

"Seawater cultivation of freshwater cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 drastically alters amino acid composition and glycogen metabolism."

Iijima H, Nakaya Y, Kuwahara A, Hirai MY, Osanai T.

Front. Microbiol. 2015, 6:326.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25954257

この辺りの論文から、筆頭著者だけでなくラストオーサー（って日本語訳あるのだろうか。最終著者？）兼責任著者（corresponding auther）の論文が増えてくる。

理化学研究所の時もそうであるが、明治大学農学部農芸化学科環境バイオテクノロジー研究室においても、シアノバクテリアを用いたバイオプラスチック・バイオエネルギー生産の研究を行っている。

普段は遺伝子改変などでポリヒドロキシ酪酸（PHB）やコハク酸、乳酸、水素などの増産を行っている。

しかし、これらは応用へ向けた一部に過ぎない。

実際には原材料となる培地を調達して、培養設備を整えて藻類を育てて有用物質を生産し、さらにそれらを回収・精製して・・・・など、応用に向けては実に様々なステップがある。これらをすべて考えていかなければならないのである。

そんな中で、微細藻類のネックに１つといえば、淡水を培養に使うことである。日本では豊富な淡水であるが、世界的に淡水は貴重な資源である。そんな貴重な淡水を無尽蔵にプラスチック生産に使うわけにはいかない。

そこで望まれるのが海水の利用である。

この論文で行ったことは極めて単純である。単細胞性のシアノバクテリアであるSynechocystis sp. PCC 6803を海水で培養したのである。海水の成分としては、窒素とリンが足りなかったので、海水に窒素とリンを加えたらシネコシスティスが育ったという極めて単純なものである。

シアノバクテリアは、藻類の中では比較的高塩濃度に強いことは知られている。海水の塩濃度と比べてみると、淡水性であるシネコシスティスも問題なく育ちそうだったので試してみたのである。なんとも単純な研究だが、全然研究されていないのである。

この論文では、さらにバッファーでpHを制御するとより増殖することや、海水で培養すると合成培地で培養するよりもなぜかオルニチンやリジン、プロリンなどが５倍以上に増えるというデータも示した。なぜアミノ酸が変化するのかは明らかになっていない。単純に塩濃度の性ではないというデータも出ている。

また、細胞のサイズも海水で培養すると変化した。全体的に大きくなるとともに、細胞のサイズの分布が広くなる傾向にあった。メカニズムなどはわかっていない。

この論文は結構注目が集まり、３つの新聞で紹介された。海水で微細藻類が培養できるというわかりやすさも手伝ったと思う。こういうコロンブスの卵的な研究をこれからも行っていきたいと考えている。

ヒスチジンキナーゼによる糖・アミノ酸代謝の改変

"Alteration of cyanobacterial sugar and amino acid metabolism by overexpression hik8, encoding a KaiC-associated histidine kinase."

Osanai T, Shirai T, Iijima H, Kuwahara A, Suzuki I, Kondo A, Hirai MY.

Environ. Microbiol. 2015, 17:2430-40.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25403325

ヒスチジンキナーゼとは、二成分制御系を構成するタンパク質の１つである。二成分制御系とは、ヒスチジンキナーゼとレスポンスレギュレーターの２つのタンパク質からなるシグナル伝達の形である。細菌に広く保存されるシグナルであるが、酵母や植物にも保存されている（農学部農芸化学科では、３、４年生の生命システム工学の講義で登場する）。

ヒスチジンキナーゼは様々なシグナルの伝達を行う。ヒスチジンキナーゼは、浸透圧や塩、窒素、リン、光強度など情報を感知して、下流のレスポンスレギュレーターに伝達するタンパク質である。

Hik8は、Synechococcus sp. PCC 7942という別のシアノバクテリアでSasAという名前がつけられているタンパク質のオーソログである。SasAは、時計タンパク質であるKaiCと相互作用し、概日リズム（サーカディアンリズム）の情報を伝達して細胞内の遺伝子を制御するタンパク質である。

SynechocystisでのHik8の働きはまだわかっていないが、本論文でKaiC1とのin vivoでの相互作用が確認されたため、SynechococcusのSasAと類似の働きをしていると考えられるが、詳しいことはわからない。

本論文でHik8の過剰発現株を構築したところ、グリコーゲンや糖リン酸などの代謝産物が減少することがわかった。グリシンやスレオニンなど、一部に増加するアミノ酸もあったが、どちらかというと減少する代謝産物が多かった。

また、RNAポリメラーゼシグマ因子SigEは、明条件から暗条件に移行すると分解していくのであるが、Hik8過剰発現株では分解されなかった。このことから、Hik8過剰発現株ではSigEを介して間接的に糖異化が変化していることが示唆された。

このように、Hik8という二成分制御系ヒスチジンキナーゼを使っても代謝が改変できるということを示したのがこの論文である。ただし、分子メカニズムの解明という点では非常に甘い内容である。KaiC1という時計タンパク質とHik8がin vivoで相互作用することを示したが、それ以外のシグナル伝達経路については解けた訳ではない。

シアノバクテリアの時計タンパク質の基礎研究は、世界的に有名なグループが非常に精力的に研究をしている。その流れの端っこに乗っても仕方ないので、あくまで代謝工学的な利用をメインに当研究室では研究を進めている。

また、どのように代謝が変化するかはまだまだ出たとこ勝負であるので、予想をすることが難しい。ヒスチジンキナーゼを用いた代謝工学の論文が今後蓄積することによって、狙い通りに代謝を制御できるようになるとよいのであるが、まだまだ先の話であると思っている。

窒素グローバルレギュレーターNtcAを用いた代謝の改変

"Metabolomic analysis reveals rewiring of Synechocystis sp. PCC 6803 primary metabolism by ntcA overexpression."

Osanai T, Oikawa A, Iijima H, Kuwahara A, Asayama M, Tanaka K, Ikeuchi M, Saito K, Hirai MY.

Environ Microbiol. 2014 Oct;16:3304-17. 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25039649

NtcAは、Nitrogen controlという言葉に由来するタンパク質であり、窒素の栄養状態を感知して遺伝子発現を制御する転写制御因子である。正確に言うと転写因子であり、RNAポリメラーゼによる転写を正または負に制御する。

NtcAの制御下には、窒素源の取り込みに関するトランスポーター遺伝子や窒素同化を行うグルタミンシンセターゼ遺伝子がある。要するに、窒素に関連する遺伝子がNtcAの制御下にある。

また、炭素同化を担うルビスコ遺伝子や光合成遺伝子もNtcAの制御下にある。さらにこれまで研究してきたSigEやRre37もNtcAの制御下である。これらの遺伝子は、直接的または間接的にNtcAによって、窒素欠乏時に遺伝子発現が変化するのである。このことから、NtcAはシアノバクテリアにおける窒素のグローバルレギュレーターであると言われている。

NtcAタンパク質には直接2-オキソグルタル酸（α-ケトグルタル酸）が結合する。2-オキソグルタル酸は、シアノバクテリアでは窒素の栄養状態を示す代謝産物として知られている。窒素欠乏時に2-オキソグルタル酸が蓄積し、これがシグナルとなってNtcAなどを活性化し、細胞の遺伝子発現を変化させることが知られている。NtcAは転写因子としてだけでなく、シグナルのセンサーとしても働いているということである。

このように、窒素のシグナル伝達の上流に位置するNtcAを改変すれば、代謝も大きく変わるだろうというのがコンセプトである。特に糖異化酵素遺伝子の正の制御因子であるSigEやRre37の上流にあるので、糖異化が促進するはずであるということである。ということで、NtcA過剰発現株を構築し、トランスクリプトーム解析やメタボローム解析を行った。

ところが、予想とは少し異なり、グリコーゲン量は減ったが、糖異化酵素はあまり増えていなかった。マイクロアレイを行ったが、それほどはっきりとしたグループの酵素遺伝子が変化したわけではなかった。窒素同化酵素や繊毛の遺伝子、TCA回路の酵素などは変化していたRre37のmRNA量やタンパク質量は増加していた。

また、NtcA過剰発現株では増殖が促進することや、フェニルアラニンやリジンなどのアミノ酸が増加することがわかった。転写制御因子を変えると代謝が変わった例はこれで３つ目となり、やはり転写制御因子の遺伝子改変は代謝工学に有効であることがここでも示されたのである。

このように、NtcAという窒素のグローバルレギュレーターを過剰発現することで、糖代謝やアミノ酸代謝を改変することには成功した。ただし、予想とはだいぶ異なる変化であり、転写制御因子を改変すると、代謝は大きく変化するものの、まだまだオンデマンドの変化を起こさせるには程遠いことも明らかになった。

糖代謝をパスウェイレベルで制御する転写因子Rre37

Pathway-level acceleration of glycogen catabolism by a response regulator in the cyanobacterium Synechocystis species PCC 6803.

Osanai T, Oikawa A, Numata K, Kuwahara A, Iijima H, Doi Y, Saito K, Hirai MY.

Plant Physiol. 2014, 164:1831-41.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24521880

これまでの研究により、RNAポリメラーゼシグマ因子SigEが糖異化遺伝子群を制御することが分かった。このSigEを過剰発現で糖代謝を改変し、バイオプラスチックであるポリヒドロキシ酪酸（PHB）や水素の生産量を増やすことに成功した。

SigEという因子を見つけたことで、シアノバクテリアの糖代謝の制御メカニズムを解明し、それを有用物質生産に利用できるようになってきたのである。

しかし、研究を続けていくうちに分かってきたことは、「糖代謝を広く制御する転写制御因子は、SigEだけではない」ということである。

このうち、大学院生時代の所属である田中寛先生の研究室で研究を進めていた因子にレスポンスレギュレーターRre37があった。この因子は東京薬科大学での研究が進められているが、SigEと似て非なる糖異化の転写制御因子である。

先行研究により、Rre37はグリコーゲンの分解酵素や解糖系の酵素の遺伝子発現を正に制御することが分かっていた。

この論文では、SigEと同様にRre37を過剰発現させ、糖代謝の変化を調べた。その結果、Rre37過剰発現株ではグリコーゲン異化酵素や解糖系酵素の遺伝子発現が増加し、炭素の貯蔵源であるグリコーゲンが減少することがわかった。

また、マイクロアレイ解析の結果、アセチルCoAからPHBを合成するための最初の２つの反応の酵素であるPhaAとPhaBの遺伝子発現が、Rre37の制御下にあることがわかった。

すなわち、SigEとは異なった形で、Rre37はグリコーゲンからPHBまでを代謝パスウェイレベルで制御していたのである。

実際にRre37過剰発現株ではPHB量が２倍に増加した。また、SigEとの二重過剰発現株ではPHB量が約３倍に増加した。

このように、たった１つか２つの遺伝子を過剰発現させることで、代謝やバイオプラスチックの量が変化することがわかったのである。

さらにRre37過剰発現株のマイクロアレイやメタボロームデータを解析すると、TCA回路とオルニチン回路のハイブリッドサイクルのようなものが存在する可能性が示唆された。

実際にこのようなサイクルが存在するかは証明できていないが、このようなハイブリッドサイクルが回ると、窒素欠乏時の代謝の動きは非常によく説明できる。

当時理化学研究所の平井優美先生の研究室にいたので、「このサイクルを平井-小山内サイクルと名づけましょう！」と言っていて、植物科学シンポジウムという大きな会議でも冗談交じりで言ったことはあった。しかし、未だに一度たりとも使われたことはない（笑）。そもそも「そういうサイクルは自分で名づけるものではなく、後に呼ばれるものだ」という先輩の意見がおそらく正しいのであろう（笑）。

それはさておき、このようなRre37という転写制御因子を用いることで、代謝や転写の基礎研究を行うとともに、バイオプラスチック量の増加という代謝工学にも成功したのである。

窒素欠乏時に炭素をどのように貯めるか？

"Capillary electrophoresis-mass spectrometry reveals the distribution of carbon metabolites during nitrogen starvation in Synechocystis sp. PCC 6803."

Osanai T, Oikawa A, Shirai T, Kuwahara A, Iijima H, Tanaka K, Ikeuchi M, Kondo A, Saito K, Hirai MY.

Environ. Microbiol. 2014, 16:512-24.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23796428

理化学研究所に移り、代謝システム研究チーム(平井優美チームリーダー)の研究室に所属した。2010年度は基礎科学特別研究員だったが、2011年度よりさきがけ専任研究者となった。さきがけについては別項で詳細に語る。

平井チームはさらに大きなくくりでメタボローム研究のグループに所属している。この縁で、理研および山形大学の及川先生とコラボできたことは非常に幸運である。

そして次から次へと幸運は巡ってくる。センターに新しく神戸大学近藤先生のチームができた。近藤先生は、日本の生物工学のトップに君臨するお方の一人である。チーム発足と同時にいらした上級研究員(現副チームリーダー)の白井先生ともコラボして研究を進めることになった。改めて振り返ると、共同研究を組ませて頂いている方々が豪華すぎる💦。恵まれているなあ・・。

この論文では、遺伝子発現とメタボローム解析により、窒素欠乏後4時間のシネコシスティスの代謝変化を調べたものである。

これまで糖異化関連遺伝子発現が窒素欠乏時に誘導されることを明らかにしてきたのだが、一方で、グリコーゲンは窒素欠乏時たまることが知られている。この矛盾を解決するためにメタボローム解析によって代謝の全体像を明らかにしたのである。

メタボローム解析の結果、窒素欠乏時にはTCA回路の有機酸が増加することがわかった。また、窒素を多く含むアミノ酸が減少し、反対に窒素の少ないアミノ酸が増加することも分かった。

窒素欠乏時にはグリコーゲンに炭素を貯蔵すると思われていたのだが、これらの結果より炭素源は有機酸などの形でも貯めておくことが示唆された。炭素源を分散させて貯蔵しておくのである。

分散させて貯蔵する理由はまだ明らかになっていないが、再度増殖を開始する際に、一箇所に炭素源があるよりも便利なのかもしれない。この辺りの疑問は今後解消していきたいと考えている。

また、この論文ではNADPHの比率が窒素欠乏時に低下することも示している。NADPHは光合成電子伝達系の最終産物であり、かつ、さまざまな代謝産物の生合成に使われる物質である。しかし、測定が難しい。白井先生の技術ではじめてきちんとNADPHを定量することができた。これは非常に大きな出来事だったと思う。

この論文はトムソン・ロイターの高引用論文にも選ばれ、メタボロームのすごさを知った論文でもある。共著者の方々には頭が上がらない。共著者の皆様ありがとうございました。

SigEによる光合成・形態・水素生産の改変

"Pleiotropic effect of sigE over-expression on cell morphology, photosynthesis and hydrogen production in Synechocystis sp. PCC 6803."

Osanai T, Kuwahara A, Iijima H, Toyooka K, Sato M, Tanaka K, Ikeuchi M, Saito K, Hirai MY.
Plant J. 2013, 76:456-65.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23941239

それにしてもこのころは本当にいろいろな歯車がうまく噛み合って研究を進めていた。充実していたが、大変な時期でもあった。おそろしい勢いで仕事をしていたと思う。

単細胞性シアノバクテリアであるシネコシスティスを用いて、有用物質の生産に取り組んでいた。当時はさきがけ専任研究者であったため、その予算を使って研究をすることもできた（ただし、子育てがもっとも大変な時期でもあった）。

RNAポリメラーゼシグマ因子SigEの過剰発現によって、糖異化を促進し、バイオプラスチックであるPHBを増加させることに成功し、論文を発表していた。

このSigE過剰発現株を色々と解析していくと、代謝だけでなくあらゆる部分が変わっていることがわかってきた。

まず、SigE過剰発現株は、細胞が大きくなっていたのである。増殖そのものも少し促進されていた。分裂面に野生株にはないリング状の構造が見られた。

また、光合成活性が変化することもわかるなど、代謝・光合成・細胞形態と、たった１つのタンパク質が増えるだけで多面的な変化をもたらすことが明らかになったのである。

さらに、SigEの制御下にある遺伝子群を解析したところ、水素の生成・消費に関わる酵素であるヒドロゲナーゼの遺伝子群があることがわかった。

水素は嫌気条件で生産されるため、SigE過剰発現株を嫌気発酵条件で培養し、蓄積した水素の量をガスクロマトグラフィーで測定したところ、野生株に比べて水素の蓄積量が２倍に増加していることが明らかになった。

このことから、SigEというタンパク質は、バイオプラスチックPHB（ポリヒドロキシ酪酸）と水素の生産の両方を制御することが明らかになったのである。

バイオプラスチックPHBと水素は全然別のものに思えるが、両方とも還元力を利用して生産される。シネコシスティス細胞は、ある時にはPHBに還元力を割り振り、また別の時には水素に還元力を割り振るのである。このバランス調節がどのような場面で必要かはまだ明らかになっていない。しかし、視点を変えると、バイオプラスチックと水素生産が繋がっているということが明らかになり、興味深い結果となった。これはその後発表したコハク酸生産と水素生産の論文にも生かされている。

このように、バイオプラスチックに加え、水素の生産に関与する因子を発見したという論文であり、格式と伝統を有するThe Plant Journalにアクセプトされたことは非常に嬉しい出来事であった。コンスタントにこのレベルのジャーナルに出していきたいのだが、なかなか難しい。チャレンジあるのみである。

バイオプラスチックPHBの増産！

"Increased bioplastic production with an RNA polymerase sigma factor SigE during nitrogen starvation in Synechocystis sp. PCC 6803."

Osanai T, Numata K, Oikawa A, Kuwahara A, Iijima H, Doi Y, Tanaka K, Saito K, Hirai MY.

DNA Res. 2013, 20:525-35.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23861321

SigEというRNAポリメラーゼシグマ因子を用いて、単細胞性シアノバクテリアであるシネコシスティスの炭素代謝を大幅に改変することができた。さてさて次はなにか有用な物質を作ろうと考えた。

2010年度より理化学研究所植物科学研究センター（現環境資源科学研究センター）に基礎科学特別研究員として異動した。通称基礎特研。３年間の任期付であるが、日本でもっとも給料のよいポスドクとして知られている。

理化学研究所に異動してすぐはシロイヌナズナの研究を行っていた。しかし、シロイヌナズナは研究の期間が長く、手軽に扱え、光合成・葉緑体のモデルであるシネコシスティスも同時に扱おうと考え、少し経ってからシアノバクテリアも研究し始めた。私は周りからシアノバクテリアをずっと続けてきたと思われているのだが、１年間くらい全く触っていなかったのである。

SigEによる糖異化促進によって、グリコーゲンの分解を促進し、アセチルCoAを増やすことができた。アセチルCoAは、クエン酸回路の手前の代謝産物であることが知られているが、他の有用物質の前駆体ともなっている。

ポリヒドロキシ酪酸（polyhydroxybutyrate）、通称PHBは、アセチルCoAから３段階の反応で合成される。SigEはグリコーゲンからアセチルCoAまでの代謝反応を促進するため、SigEの過剰発現（SigEのタンパク質量を増やすこと）によって、PHBが増えるのではないかと考えた。

実際に詳しく解析してみると、なんとSigEの制御下にPHB合成酵素であるPHBシンターゼが入っていることがわかった。すなわち、SigEはもともとグリコーゲンからPHBまでの代謝経路を包括的に正に制御していたのである。

SigE過剰発現株を窒素欠乏状態にしてPHBを合成させたところ、野生株と比べて2.5倍にPHB量が増加していることが明らかになった。

このように、代謝酵素の改変ではなく、SigEという「転写制御因子」を改変することによってバイオプラスチックであるPHB量を増加させることに成功した。

たった１つの遺伝子を過剰発現することで代謝経路を包括的に制御することができ、かつ、バイオプラスチックとなる代謝産物量を増加させることができる。転写制御因子の代謝工学への利用はここから始まったのである。

SigEを用いた遺伝子工学による糖異化促進

"Genetic engineering of group 2 sigma factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803."

Osanai T, Oikawa A, Azuma M, Tanaka K, Saito K, Hirai MY, Ikeuchi M.

J. Biol. Chem. 2011, 286:30962-71.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21757761

学位を取得後、東大総合文化研究科の池内先生の研究室に日本学術振興会特別研究員(PD)として移った。ポスドク生活のスタートである。

はじめの1年間はあまりうまくいかず。3つ、4つのテーマを試したが、ぱっとせず。さらっと書いているが、大変なことである💦。

当時の研究室に遺伝子の過剰発現用のベクターがあった。しかし、もっぱら酵素の精製用に使われており、遺伝子工学として細胞や代謝の改変には使われていなかった。

そこでこのベクターを用いて、細胞の改変、特に代謝工学を行おうと考えた。すでに糖異化のグローバルレギュレーターであるSigEを同定していたので、このSigEを過剰発現すれば代謝が大きく変化すると考えた。特にグリコーゲンという炭素の塊の分解を促進する因子なので、炭素の流れを変えて色々な物質の生産に利用できるのではないかと考えた。

このコンセプトは、今に至るまで続いているのだが、当時の反応は至って冷ややか。代謝工学が流行る前だったので日本のシアノバクテリアの分子生物学の研究者からはあまり良い反応を得られなかった。唯一、味の素（株）の研究者が発表を聞いて、これは何か発展するのではないかと期待をもって声をかけてくれたことを今でも覚えている。

ところが、論文はJ. Biol. Chem.という生化学伝統の雑誌に、割とあっさりと通った。そして、ちょうどこのころ代謝工学ブームがやってくる。アメリカの研究者の先見性と懐の深さには本当に頭が下がる。

そして、この論文より強力な味方である山形大学及川先生とコラボすることができた。及川さんには現在に至るまでずっとお世話になっている。この論文でキャピラリー電気泳動マススペクトロメトリーによるメタボローム（CE-MS）解析を行って頂いた。この解析の結果、SigEを過剰発現することで、アセチルCoAやクエン酸などの糖異化下流の代謝産物が増加することが明らかになった。

このSigE過剰発現株は、今に至るまで非常に重要な代謝工学の基礎となる大事なものである。そして、理化学研究所に移籍して、すばらしい共同研究者に恵まれ、研究が加速していくことになる。