シアノバクテリアからのRNA抽出

RNAの測定は、転写産物量解析、トランスクリプト解析などと呼ばれる。以下は、キットなどを使わず、Isogenという試薬を使ったRNAの抽出方法である。シアノバクテリアは多糖類のコンタミネーションのためか、きれいなRNAを取ることが難しいことが知られている。

多糖を除くためには、色々な試薬なども売られているが、経験上もっともうまくいった方法は「イソプロパノール沈殿（またはエタノール沈殿）をたくさん行うこと」である。エタノール沈殿だと冷やす時間が必要なので、当研究室ではイソプロパノール沈殿を使っている。

RNAの抽出
細胞(培養液30 mL程度)を500 μLのTE+0.5% SDSに懸濁。等量の酸性フェノールを加える

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65℃で10-15分間インキュベート。２、３分ごとに混ぜる。
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遠心15,000 rpm x 5 min, 室温
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上清を新しいマイクロチューブに移す。等量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（PCI）を加えて混ぜる。
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遠心15,000 rpm x 3 min, 室温
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上清を新しいマイクロチューブに移し、等量のPCIを加えて混ぜる。

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遠心15,000 rpm x 3 min, 室温
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PCI抽出を３、４回繰り返す。

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1/10量の3M酢酸ナトリウムと等量のイソプロパノールを加える
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遠心15,000 rpm x 10 min, 4℃
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上清をデカントで捨て、70%エタノール 200 μLを加える

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遠心15,000 rpm x 3 min, 4℃
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上清を捨てる。ここは乾燥なし。
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TE100 μLに懸濁。1 mL Isogenを加え、よく混ぜる。室温で5分間静置。
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200 μLクロロホルムを加える。よく混ぜる。室温で2、３分間静置。

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遠心15,000 rpm x 15 min, 4℃
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上清を新しいエッペンに入れ、等量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールを加え、混ぜる
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遠心15,000 rpm x 3 min, 4℃
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再度PCI処理（同上）※中間相がきれいになるまで繰り返す。
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0.8 volume イソプロパノールを加える。混合。
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遠心15,000 rpm x 10 min, 4℃
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上清を捨て、1 mL 70%エタノールを加える
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遠心15,000 rpm x 3 min, 4℃
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上清を捨て、軽く乾燥。滅菌水に懸濁。

DNAの除去

TURBO DNase (Thermo Fisher Scientific)を用いてDNAを完全に除去する。これによって、リアルタイムPCRやマイクロアレイにも利用できるクオリティのRNAを生成することができる。

RNA溶液に1/10量のTURBO DNase Bufferと1 μL TURBO DNaseを加える。

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37℃で４〜５時間インキュベート

※プロトコールだとDNaseの反応は20~30分間になっているが、シアノバクテリアの場合は足りない。使用目的によって変える。マイクロアレイなど、多少DNAが残ってもいい場合は30~60分間にする。リアルタイムPCRなど、完全に取り除きたい時には４、５時間インキュベートする。

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RNase-free水でメスアップし、PCI処理およびイソプロ沈を行う。

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TEまたはRNase-freeの水に懸濁する。

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NanoDropなどで定量する。

-30℃ or -80℃で保存。

※プロトコールは必ず他の文献などでもご確認ください。