6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの活性測定

6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（6PGD）の酵素活性測定
6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（6PGD）はグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）と並び、酸化的ペントースリン酸経路の鍵酵素である。NADPHという還元力を生産することから、細胞内の酸化還元バランスに重要であると考えられている。ちなみにシアノバクテリアでは、参加的ペントースリン酸経路がグルコースを資化する主要な経路として知られている。

準備する溶液
100 mM HEPES-KOH (pH7.5)
100 mM glucose-6-phosphate

細胞培養液（20~50 ml分）から細胞を回収。凍結保存。
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細胞を1 mL HEPES-KOH (pH7.5)に懸濁。氷上で冷やす。
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超音波破砕を行う。当研究室ではSonics社製のVC-750を用いている。10 sec x 6~7回。
※SDS-PAGEの場合よりも、温度に気をつけて破砕する。常に氷上で操作を行う。絶対に溶液が熱くならないようにする
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遠心 15000 rpm x 5 min, 4℃
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上清を新しいマイクロチューブにうつす。
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BCAで細胞抽出液のタンパク質定量を行う。
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40 μg totalタンパク質分の上清を新しいマイクロチューブに入れる。HEPES-KOH (pH7.5)でTotal 100 μLにする。
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100 mM HEPES-KOH (pH7.5) 700 μL
20 mM NADP+ 50 μL　を加える。
反応溶液のTotalは　850 μL。
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25℃のヒートブロックで3 minインキュベート
※温度変化を調べる時は、この部分の温度を適宜変える。
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A340の変化を2 min測定（1分間の変化量をA1とする）
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100 mM 6-phosphategluconate 100 μlを加える
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A340の変化を2 min測定（1分間の変化量をA2とする）

A = A2-A1
１分間に1μmol NADPHを生成する活性を1 unitとする。
unit/mg total protein = A/6.2 x 0.95 / total protein (mg)
6.2: NADPHのミリモル吸光係数, 0.95: 反応溶液のvolume (mL)
※Totalの反応液量は適宜変えてもよい。

G6PDと並び、6PGDも比較的測定が簡単な酵素であると思う。活性が弱い場合には、反応させるタンパク質溶液の量を調節する。

※プロトコールは必ず他の文献などでも確認してください。