窒素欠乏時のトランスクリプトーム解析

"Nitrogen induction of sugar catabolic gene expression in Synechocystis sp. PCC 6803."

Osanai T, Imamura S, Asayama M, Shirai M, Suzuki I, Murata N, Tanaka K.

DNA Res. 2006, 13:185-95.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17046957

これが３本目の論文である。当時博士課程３年生（D3）であった。

この論文で行ったことは極めて単純である。当時日本のシアノバクテリア研究業界は非常に力があり、世界の最先端を行っていた。

日本のシアノバクテリア研究者が協力し、マイクロアレイを完成させた。マイクロアレイ解析とは、細胞内の遺伝子発現量（mRNA量）をスライドグラスなどのチップ上で網羅的に測定する解析手法である。遺伝子発現を網羅的に測定することをトランスクリプトーム解析またはトランスクリプトミクスと呼ぶ。CyanoChipと名付けられたマイクロアレイは、タカラバイオから発売され、誰でも購入できるように製品化された（現在は販売中止になってしまった）。

このマイクロアレイを用いて、シアノバクテリア(シネコシスティス)の窒素欠乏時の転写産物量の変化を網羅的に解析した。窒素充足時と窒素欠乏後4時間の2つを比べるスナップショット解析であった。

窒素欠乏時には、光合成や炭素同化、翻訳関連の遺伝子発現が低下することや、一過的に窒素の取り込みや窒素同化関連の遺伝子発現が増加することは知られていた。

しかし、マイクロアレイを用いることで、これまで知られていなかった窒素欠乏時の転写産物量の変化が明らかになった。例えば、糖異化関連遺伝子や呼吸関連遺伝子の発現量が、窒素欠乏によって包括的に増加することが明らかになった。

この糖異化関連遺伝子の発現誘導に、シアノバクテリアにおけるグローバルな転写因子であるNtcAがり必須であることを明らかにした。一方、糖異化のグローバルレギュレーターとして同定したSigEについては、必ずしも糖異化関連遺伝子の発現誘導には必須ではなく、SigEに依存する遺伝子と依存しない遺伝子があることが明らかになった。

このように、シアノバクテリアの窒素欠乏時の転写産物量の変化を初めて網羅的に明らかにするとともに、複数の転写制御因子が糖異化関連遺伝子の転写制御に関わることを明らかにした。

マイクロアレイの実験は、１回行うだけで１０万円以上かかる。かなり緊張しながら実験をしたのは良い思い出ある。結果としては、ほとんどミスったことはなかったが、保管が悪くてシグナルが低下するなどはあった。現在は、CyanoChipは販売中止になっており、個別に作らなければいけないのが残念がところである。

プレスリリースとは？

昨日明治大学のホームページより、２件のプレスリリース同時を行った。
https://www.meiji.ac.jp/#tab2

1. ラン藻の乳酸脱水素酵素の生化学解析
https://www.meiji.ac.jp/koho/press/2017/6t5h7p00000pmv9h.html

2. ラン藻の遺伝子クラスター解析とコハク酸生産
https://www.meiji.ac.jp/koho/press/2017/6t5h7p00000pmvfs.html

プレスリリースとは、報道発表のことであり、報道機関などに向けて、情報を告知・提供することである。一般の人だけでなく、プレスすなわち報道機関・メディア（新聞社、テレビ局、ウェブニュース運営会社など）に向けての情報告知であるという点が１つのポイントである。

報道機関はプレスリリースをすべて記事にするのではなく、ニュースバリューがありそうなものを選択して記事にしていく。ただし、紙面には限りがあるが、Webの場合は大量の情報を掲載することができる。最近はWebのみで研究機関や大学のプレスリリースがそのまま転載されることもある。

朝日新聞デジタル版でも、@pressというサイトがそのまま転載されているらしく、乳酸脱水素酵素の記事も下のようにリンクされている。
http://www.asahi.com/and_M/information/pressrelease/CATP2017142751.html
@pressというサイトがどれくらいの記事をリンクしているかは定かではないが、科学技術だけでなく幅広くプレスリリースを集めているらしい。

環境バイオテクノロジー研究室では、科学技術振興機構（JST）のALCAという研究費を使用しており、他にも日本学術振興会（JSPS）の科研費（新学術領域、分担）も使用している。これらの予算は税金であり、研究をする以上はその結果を世間に発表することが求められる。

一般的には学術論文にして研究成果を世界に発信するのであるが、学術論文は専門家以外が理解することは極めて困難である。近年は高度に専門が細分化されており、少し分野を外れると、原著論文を読むにはかなりの労力を要する。

そこで、上記のようなプレスリリースを行う。論文を和文に訳し、なるべく一般の人でもわかるように平易な単語を使って記事を書く。これがなかなか難しく、研究室で当たり前のように使っている専門用語が説明なしには使えないので、文章の作成に四苦八苦することになる。

また、ビジュアルについても論文と全く考え方が異なる。論文では、意味もなくグラフを３次元したり、影をつけたりしてはいけない。なるべくシンプルに書くことを要求される。一方で、プレスリリースではいかに目を惹くかが重要であるため、グラフを立体的にしたりしてもよい（もちろん数値を変えたり、誤解を与えるような表現にしてはいけない）。原著論文とプレスリリースでは正反対のことを要求されるので、この頭の切り替えがなかなか難しいのである。

自分の研究を人にわかりやすく説明するのはとても難しい。しかし、とても勉強になるし、内容だけでなく、世の中の情報の動きを垣間見ることもできる。

論文を投稿してアクセプトされそうになったら、急いで和文の記事を書かなければいけないのでとても大変なのであるが、環境バイオテクノロジー研究室では、プレスリリースを積極的に配信するようにしている。新聞やその他メディアで取り上げられると、純粋にうれしいことも大事な要因である。

ウエスタンブロット

●ウエスタンブロット

ウエスタンブロットはタンパク質を特異的に検出する非常に重要な方法である。良い抗体を購入または作製する必要があるが、一度良い抗体ができると再現性の良いタンパク質の定性・定量分析が可能となる。

必要な機器

セミドライブロッター（日本エイドー社製など）

ロータリーシェイカー

必要な試薬・消耗品

SDS-PAGE関連試薬

トランスファーバッファー

　Tris 3 g, グリシン 14.4 gをMillQを全量800 mLになるように溶解させる。200 mLメタノールを加え、全量を1 Lにする。

メンブレン（Immobilon Transfer Membrane IPVH20200など）

クロマトグラフィーペーパー （Whatman 100シート 3030-6185など）

タッパー、プラスチックコンテナなど

メタノール

BSA(アルブミン、牛血清由来)

PBS-T

一次抗体

二次抗体

NBT/BCIP溶液（Thermo SCIENTIFIC社

1-Step NBT/BCIP,250mL

Prod34042など）

作製したSDS-PAGEゲルを用いて、電気泳動を行う。等量ずつのTotalタンパク質量になるようにアプライする。
↓
電気泳動の間にトランスファーメンブレンを準備する。

メンブレンをメタノールに１min浸ける。

※このメタノールは別のメジュームビンなどに入れ、再利用可能

↓

クロマトグラフィーペーパー６枚とメンブレン１枚をトランスファーバッファーに浸けておく。

※トランスファーバッファーは繰り返し使える。

↓

電気泳動後、ゲルをトランスファーバッファーに浸ける。3~ 5 min。

↓

セミドライブロッターを用いて、メンブレンに転写 。
140 mA for 40~70 min 。

※電圧の値に注意する。40 mV 以上になっていたら、電流の値を下げる。 定電圧（10~20 mVで行っても良い）

※分子量の大きいタンパク質(＞100 kDa以上)では転写の時間を70~120 minにする。
↓
３％BSA in PBS-Tにメンブレンを入れる（プラスチックのタッパーを使う）
ロータリーシェイカー（レシプロ式でも良い　）を使い、室温で50 min以上振盪。Overnight可。
↓
PBS-Tを7~15 mL加え、一次抗体を加える。※一次抗体はスピンダウンしてから使う。室温で40 min以上振盪。Overnight可。
↓
PBS-Tで5 min x 3回洗浄。※PBS-Tは充分量入れる。ここでケチると汚くなる。
↓
PBS-Tを10 mL加え、二次抗体を加える。室温で40 min~2 h振盪。Overnightは不可。
※二次抗体は遠心でスピンダウンしてから使う。遠心をしないと、アグった抗体がはいってしまい、検出のバックグラウンドが上がる。

※二次抗体は少ないほどきれい。心配で多く入れてしまいがちだが、1:10,000~1:20,000の希釈倍率で良い（当研究室では1:20,000、すなわち10 mLに対して0.5 μL）

↓
PBS-Tで5 min x 3回洗浄。

※PBS-Tは充分量入れる。ここでBufferを検出のバックグラウンドが上がる。 

※5 min以上〜１ hでも問題ない。
↓
NBT/BCIP溶液を加える。MillIQを入れたタッパーなどを用意しておき、バンドが十分に見えたらMilliQでよく洗浄する。

※反応時間はタンパク質によって異なるため、反応時間を記録しておくと次回以降の参考になる。

↓

ペーパータオル上で乾燥させ、スキャナで画像を取り込む。

↓

画像をTIFFに変換し、ファイルにImageJなどのソフトで定量化する。

※プロトコールにつきましては、必ず他の文献などでもご確認ください。

生田キャンパスの紅葉

明治大学農学部と理工学部がある生田キャンパスは、神奈川県川崎市にある。有名な駿河台のリバティータワーに農学部はありません💦

小田急線沿いであるため、新宿からのアクセスが良く、神奈川からのアクセスも悪くない。のどかでとても良い場所にある（御茶ノ水の華やかとは対照的である）。都心から少し離れているのでとても自然豊かである。

１１月は紅葉の季節で、木々が見事に色づいている。

こちらは図書館前の写真である。天気の良い日には空の青色、雲の白色とともに木々の黄色や緑色のコントラストがとてもきれいである。

個人的なことだが、こんな風に景色のことを考えられるようになったのは、実は最近かもしれない。

勉強や研究に没頭すると、どうしても気持ちが疲れることがある。他にも人間関係などで悩むことがあるだろう。

本当に何でもないことであるが、ちょっと勉強や研究、仕事をやめて散歩しにいったり、1日休んで自然に触れたり美味しいものを食べるのは非常に大事である。悩んでしまったり、あまりにも忙しくなってしまうとこういうことすらできなくなってしまう。ブラック企業に勤めて病んでしまう人に対して、周りの人は「辞めればいいのに！？」と不思議に思うのは、あまりにも忙しくて思考停止に陥ってしまうからである。

私も子供が少し大きくなってきたので余裕が生まれるようになってきたが、明治大学着任前は研究も子育ても恐ろしく忙しかった。恐ろしく時期は、自然の美しさなんて全く目に入らなかった。今どんな花が咲いていて、どんな気候かなんて考える暇もなく日々が過ぎ去っていく感じであった。

しかし、思い返してみると、１日２０〜３０分間の時間が取れないかというとそうでもなかった。日本人は休む勇気が足りないというが、まさにそれに当てはまってしまっていることも多かった。

少し時間でも外を散歩したりするだけで、気分がリフレッシュし、逆に仕事の効率が上がることがある。落ち着いてみると休んでも対して問題ないのだけれど、どうしても磯がいいと忘れてしまう。

せっかく綺麗な生田キャンパスであるので、仕事の合間には散歩でもしてリフレッシュしてみたいと思うし、勉強や研究で疲れた学生にもぜひお勧めしたいと思っている。

SDS-PAGEのサンプル調製

SDS-PAGEで分子量に依存したタンパク質の分離を行うために、SDSを含んだバッファーと混合する必要がある。

細胞のサンプル調製では、まず細胞を適切なバッファーで破砕してタンパク質を定量する。その後、SDS-sample bufferを加えて熱することで、SDSに包まれたタンパク質の溶液が完成する。サンプルバッファーには、比重を増加させるスクロースや還元剤であるメルカプトエタノール、目印となる色素（ブロモフェノールブルー）などが含まれている。匂いが強いので、換気の良い場所で実験を行う。

必要な器具

超音波破砕機 ※グラスビーズなど細胞を破砕しても良い。
ヒートブロック、湯浴など

必要な試薬

◯4x SDS-sample buffer
　 1M Tris-HCl (pH6.8)　　2.5 mL
    2-メルカプトエタノール　2 mL
    SDS                             0.8 g
    スクロース　　　　　　  2 g
    ブロモフェノールブルー  少量（耳かき一杯弱）
　 MillQ水で10 mLまでメスアップ
◯PBS-T(1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 81 mM Na2HPO4·12H2O, 14.7 mM KH2PO4, 0.05% Tween-20)
◯Complete mini
◯Pierce BCAタンパク質アッセイキット

細胞の破砕
細胞を500 μLのPBS-T with Complete miniに懸濁（Complete miniはプロテアーゼ阻害剤。10 mL程度のPBS-Tに１タブレットを砕いて一欠片加えて溶解させる）。
氷上でよく冷やしながら行う。
↓
超音波破砕機で細胞を破砕
VC-750（Sonics）Intensity 20~30% x 10~20 sec
↓ 氷上でよく冷やす。
↓
超音波で破砕
↓
氷上でよく冷やす。これを繰り返し、５〜６回行う。
↓
遠心分離(15,000 rpm x 5 min, 4℃)
↓
上清を氷上で冷やしておいたマイクロチューブに移す。

I). タンパク質定量 
当研究室ではBCA法を用いている。Bradford法だとタンパク質量と吸光度の相関が悪い気がする。
希釈した上清 40 μLとBCA溶液 800 μLを混合する。
※この混合比率はプロトコールとは異なる。
※上清の希釈率は細胞量による。
※同時にBSAの検量線を作る。
↓
37℃で30分間インキュベート
↓
OD562で吸光度を測定。タンパク質濃度を算出する。

II). タンパク質サンプルの調製
上清と4xSDS-sample bufferを1:1~3:1の比率で混合する。
↓
98℃で3~5分間インキュベート
↓
-30℃で保存。
I)で算出したタンパク質濃度を用いて、SDS-PAGEを行う。

※プロトコールにつきましては、必ず他の文献などもご確認ください。

SDS-PAGE

ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミド電気泳動(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide electrophoresis、通称SDS-PAGE）は、タンパク質の分離と検出に使われる実験系である。

SDS-PAGEでは、２枚のガラス板の間にポリアクリルアミドゲルを作製し、分子ふるい効果によってタンパク質などの高分子を分離する。SDSを用いてタンパク質を陰イオンに荷電および変性させることで、タンパク質の電荷や構造に依存せず、分子量に依存してタンパク質を分離させる。

必要な器具
ミニゲル用ガラス板
スペーサー
コーム
ミニゲルスラブ電気泳動装置
クリップ
電源装置
※日本エイドー株式会社などのHPを見て一式を揃える。

日本エイドー株式会社電気泳動装置

必要な試薬
30%(w/v)アクリルアミド/ビス混合溶液（一般的には37.5:1）
4x Running gel buffer
4x Stacking gel buffer
10% APS（過硫酸アンモニウム）溶液　※遮光して冷蔵保存
TEMED溶液

4x Running gel bufferは、Tris 36.4 gとSDS 0.8 gを180 mL程度のMillQ水に溶かし、HClでpHを8.8に合わせ、その後250 mLにメスアップする。4x Stacking gel bufferは、Tris 12.2 gとSDS 0.8 gを180 mL程度のMillQ水に溶かし、HClでpHを6.8に合わせ、その後200 mLにメスアップする。


これらの試薬を以下の比率で混ぜる。

	15%ゲル	12%	8%	6%
Running Gel Buffer	3.75 ml	3.75 ml	3.75 ml	3.75 ml
滅菌水	3.6 ml	5.1 ml	7.1 ml	8.1 ml
30%アクリルアミド溶液	7.5 ml	6.0 ml	4.0 ml	3.0 ml
APS	180 μl	180 μl	180 μl	180 μl
TEMED	18 μl	18 μl	18 μl	18 μl

※ミニゲル２枚分

Stacking Gel Buffer	1.5 ml
滅菌水	3.5 ml
30%アクリルアミド溶液	1.0 ml
APS	80 μl
TEMED	8 μl

SDS-PAGEゲルの作製
※ガラスや毒物を扱うため、安全には充分に注意をする。
SDS-PAGEのゲル板を組み立てる。
↓
TEMED以外を予め混ぜておいたRunning gel溶液をビーカーに用意しておく。
↓
Running gel溶液にTEMEDを加え、すぐによく混ぜる。
↓
ゲル板に溶液をそっと流し入れる。
↓
すぐに上からイソプロパノールを2, 3mL程度重層する。
↓
20~30分くらい静置する。
↓
イソプロパノールを捨て、3~5 mLの蒸留水を静かにゲルに注ぎ、捨てる。この洗浄操作を２回繰り返す。
↓
TEMED以外を予め混ぜておいたStaking gel溶液をビーカーに用意しておく。
↓
Staking gel溶液にTEMEDを加え、そっと混ぜる。
↓
Running gelの上に重層し、すぐにコーム（くし）を挿す。
↓
30分間以上静置する。その後、乾燥しない工夫をして、冷蔵庫で保存する。

↓

用意したサンプルをアプライし、Stacking gelの部分までは10 mA~15 mA、Running gelの部分では20 mAで通電する。ただし、電圧の値が上がりすぎた場合（180 V以上）は、電流値を下げる。
↓
ゲル板からゲルを外し、染色やウエスタンブロッティングなどに用いる。

※プロトコールにつきましては、必ず他の文献などでもご確認ください。

アルバイトできますか？

こちらも研究室訪問でよくある質問が「アルバイトはできるでしょうか？」である。

結論から言うと、「アルバイトをしている学生の方が多い」という回答になる。なので、環境バイオテクノロジー研究室に所属して「アルバイトをすることは可能」である。割合についてはあまりわからないが定期的なアルバイトは多分半分以上の人が行っていて、短期的なアルバイトを含めると８割くらいの人がアルバイトをしているのではないかと思う。

アルバイトの内容は様々だと思う。一般的なファーストフードやカフェやレストランなどの飲食店、塾の講師などだろうか。先生へのアルバイトの報告義務はないので、各自がそれぞれ自分で考えていろいろな業種のアルバイトをしているのだと思う。思うと書いたのはなぜかというと、学生との会話の中でアルバイトの話が出てくると「そうなんだ」というように知るくらいで、把握はしていない。

大学院生になるとアルバイトの頻度が減るかもしれない。TAなどの制度もあるので、短期のアルバイトにしている人が多い傾向にあると思う。ただ、定期的にアルバイトをしている人もいると思うので、人それぞれだろう。大学院生ともなれば、立派な大人なので個人の自由になる（うちの場合は学部生も自由）。

個人的には、アルバイトに夢中になりすぎると、せっかくの時間がアルバイトに取られてしまい、学費を払っているのにもったいないとは思う。研究室は狭いのであるが、割と豊富な研究機器を有している。超高額の研究機器はないが、一般的な代謝工学、分生生物学、生化学については行うことができる。酵素活性測定などの生化学が十分に研究できるように、分光光度計を複数備えている。エンドオン型という特殊な分光光度計を含めると、分光光度計を４台備えているのは結構珍しいのではないかと思う（核酸定量用のNanodropも別にある）。

居室は狭いのだが、たくさん研究できる機会なのでぜひたくさん実験をしてもらいたいとは思っているが、時間の使い方は各人に任せている。

このように、学費を稼ぐために必要なアルバイトだが、環境バイオテクノロジー研究室の場合は「アルバイト可能」である。各人で時間の使い方を考えてくれれば、問題ない。