Instagramはじめてみました。

いまさらだけれど、先月11月からInstagram（インスタグラム）を始めています。

https://www.instagram.com/osanai_meiji/
これは小山内の個人アカウントです。
https://www.instagram.com/meiji_biotechnology/
こちらは環境バイオテクノロジー研究室の公式アカウント

明治大学に赴任したのが2015年4月。ずっとガラケーで、赴任半年前にやっとスマホに変えたという流行りに遅れている人間だった。

最初に、環境バイオテクノロジー研究室の１期生と連絡手段を確立する必要があり、当然メールかと思ったら「えっ、LINEじゃないんですか？」といった反応だったので、そこでLINEをやっと始める。もちろん、長文を送るのが大変なので、研究室のメーリングリストもある。

その後、学生たちに影響され、特に自分の担任である現在の２年生に話を聞き、ツイッターを始めることになる。2016年の春だったと思う。一時期かなりの頻度でつぶやいていたけれど、つぶやいてもあまり得るものがないことが多いので、最近は論文や学会、明治大学の広報的な報告が多くなっている。

また、研究室内のデータ共有にはDropboxを使っている。私は結構好きなのだが、研究室共有フォルダのサイズが大きくなると、無料版では対処できなくなるという問題も出てきている。私のDropboxは容量を大きくしたので問題ないのだけれど、デフォルトの無料版を使っている場合にはこれが問題になっている。しかしながら、クラウドは本当に便利で、今や仕事に欠かせない。iPhoneからアクセスできるのも非常に便利である。

予算を頂いている新学術領域「新光合成」では、サイボウズLiveを使って情報共有している。個人的には少し使いにくいが、大人数のデータ共有はこのようなものがないと不可能なので、良いのだと思う。ただし、無料版が終わってしまうというニュースが飛び込んできたので、移行が必要である。

最近になって、このブログを始めた。ツイッターはつぶやいても残らない（正確には検索しにくい）。プロトコールなどもDropboxにワードファイルであるのだけれど、アクセスが面倒である。また、ウェブ上に公開してあるプロトコールはとても便利であり、科学の発展には大事である。

また、研究室の紹介をホームページに載せているのだけれど、ホームページソフトが使いにくい・・・自分でソフトを買って作っているけれど、Word感覚ではとても作れない。また、商売の問題ですぐにソフトがアップデートしてしまい、旧バージョンは保証されなくなるという問題もある。そこでもっと見やすい研究室の紹介をしようと思い、ブログを作成した。よくある質問などを載せておけば、研究室選びに役立つのではないかと思う。

さらに、アドセンスにも挑戦したいと思っている。研究だけでなく、ビジネスにも幅広い視点を持つのが環境バイオテクノロジー研究室の目指すところである。

そして今回、Instagramを始めてみた。情報過多の時代。どんなに良いことを書いていても、読んではくれない。一瞬で興味を引くことが大事である。その点では、やはり写真や動画に勝るものはないと思う。

このように、辛そうな韓国料理はインスタ映えすることもわかった（これはブログだけれど）。このように、いかに興味を惹けるかも勉強していきたいと思っている。

Instagramを始めた理由についてはもっといろいろあるのだけれど、それは別の機会にたくさん書く予定です。

赴任して３年目になり、少し環境が落ち着いたので、どんどん新しいことにチャレンジしようと思っている。辞めるのは別に簡単なので、色々学んで行動してみて、より面白い展開になるように発展させていきたいと考えている。大学の先生は自由なのである。

6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの活性測定

6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（6PGD）の酵素活性測定
6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（6PGD）はグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）と並び、酸化的ペントースリン酸経路の鍵酵素である。NADPHという還元力を生産することから、細胞内の酸化還元バランスに重要であると考えられている。ちなみにシアノバクテリアでは、参加的ペントースリン酸経路がグルコースを資化する主要な経路として知られている。

準備する溶液
100 mM HEPES-KOH (pH7.5)
100 mM glucose-6-phosphate

細胞培養液（20~50 ml分）から細胞を回収。凍結保存。
↓
細胞を1 mL HEPES-KOH (pH7.5)に懸濁。氷上で冷やす。
↓
超音波破砕を行う。当研究室ではSonics社製のVC-750を用いている。10 sec x 6~7回。
※SDS-PAGEの場合よりも、温度に気をつけて破砕する。常に氷上で操作を行う。絶対に溶液が熱くならないようにする
↓
遠心 15000 rpm x 5 min, 4℃
↓
上清を新しいマイクロチューブにうつす。
↓
BCAで細胞抽出液のタンパク質定量を行う。
↓
40 μg totalタンパク質分の上清を新しいマイクロチューブに入れる。HEPES-KOH (pH7.5)でTotal 100 μLにする。
↓
100 mM HEPES-KOH (pH7.5) 700 μL
20 mM NADP+ 50 μL　を加える。
反応溶液のTotalは　850 μL。
↓
25℃のヒートブロックで3 minインキュベート
※温度変化を調べる時は、この部分の温度を適宜変える。
↓
A340の変化を2 min測定（1分間の変化量をA1とする）
↓
100 mM 6-phosphategluconate 100 μlを加える
↓
A340の変化を2 min測定（1分間の変化量をA2とする）

A = A2-A1
１分間に1μmol NADPHを生成する活性を1 unitとする。
unit/mg total protein = A/6.2 x 0.95 / total protein (mg)
6.2: NADPHのミリモル吸光係数, 0.95: 反応溶液のvolume (mL)
※Totalの反応液量は適宜変えてもよい。

G6PDと並び、6PGDも比較的測定が簡単な酵素であると思う。活性が弱い場合には、反応させるタンパク質溶液の量を調節する。

※プロトコールは必ず他の文献などでも確認してください。

グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼの活性測定

グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）の酵素活性測定
グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼは、酸化的ペントースリン酸経路の最初の酵素である。代謝の分岐点となる酵素であるとともにNADPHという還元力を生産することから、この経路の鍵酵素として知られている。この酵素の活性を測定することで、酸化的ペントースリン酸経路がどのくらい働いているかの指標にすることできる（もちろん代謝フラックスと一致しているとは限らない）。

準備する溶液
Buffer A (55 mM Tris-HCl, pH8.0, 3.4 mM MgCl2)
20 mM NADP+
100 mM glucose-6-phosphate

細胞培養液（20~50 ml分）から細胞を回収。凍結保存。
↓
細胞を1 mL BufferA (55 mM Tris-HCl, pH8.0, 3.4 mM MgCl2）に懸濁。氷上で冷やす。
↓
超音波破砕を行う。当研究室ではSonics社製のVC-750を用いている。10 sec x 6~7回。
※SDS-PAGEの場合よりも、温度に気をつけて破砕する。常に氷上で操作を行う。絶対に溶液が熱くならないようにする
↓
遠心 15000 rpm x 5 min, 4℃
↓
上清を新しいマイクロチューブにうつす。
↓
BCAで細胞抽出液のタンパク質定量を行う。
↓
90 μg totalタンパク質分の上清を新しいマイクロチューブに入れる。BufferAでTotal 200 μLにする。
↓
BufferA 600 μL
20 mM NADP+ 50 μL　を加える。
反応溶液のTotalは 850 μL。
↓
25℃のヒートブロックで3 minインキュベート
※温度変化を調べる時は、この部分の温度を適宜変える。
↓
A340の変化を2 min測定（1分間の変化量をA1とする）
↓
100 mM glucose-6-phosphate 100 μlを加える
↓
A340の変化を2 min測定（1分間の変化量をA2とする）

A = A2-A1
１分間に1μmol NADPHを生成する活性を1 unitとする。
unit/mg total protein = A/6.2 x 0.95 / total protein (mg)
6.2: NADPHのミリモル吸光係数, 0.95: 反応溶液のvolume (mL)
※Totalの反応液量は適宜変えてもよい。

G6PDの活性測定は特に注意点もなく、比較的簡単に測定できると思われる。精製タンパク質を用いる場合は、Buffer AとNADP+溶液さえあれば測定できる。生物によって細胞の破砕方法は検討する必要があると思われる。

SigEによる光合成・形態・水素生産の改変

"Pleiotropic effect of sigE over-expression on cell morphology, photosynthesis and hydrogen production in Synechocystis sp. PCC 6803."

Osanai T, Kuwahara A, Iijima H, Toyooka K, Sato M, Tanaka K, Ikeuchi M, Saito K, Hirai MY.
Plant J. 2013, 76:456-65.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23941239

それにしてもこのころは本当にいろいろな歯車がうまく噛み合って研究を進めていた。充実していたが、大変な時期でもあった。おそろしい勢いで仕事をしていたと思う。

単細胞性シアノバクテリアであるシネコシスティスを用いて、有用物質の生産に取り組んでいた。当時はさきがけ専任研究者であったため、その予算を使って研究をすることもできた（ただし、子育てがもっとも大変な時期でもあった）。

RNAポリメラーゼシグマ因子SigEの過剰発現によって、糖異化を促進し、バイオプラスチックであるPHBを増加させることに成功し、論文を発表していた。

このSigE過剰発現株を色々と解析していくと、代謝だけでなくあらゆる部分が変わっていることがわかってきた。

まず、SigE過剰発現株は、細胞が大きくなっていたのである。増殖そのものも少し促進されていた。分裂面に野生株にはないリング状の構造が見られた。

また、光合成活性が変化することもわかるなど、代謝・光合成・細胞形態と、たった１つのタンパク質が増えるだけで多面的な変化をもたらすことが明らかになったのである。

さらに、SigEの制御下にある遺伝子群を解析したところ、水素の生成・消費に関わる酵素であるヒドロゲナーゼの遺伝子群があることがわかった。

水素は嫌気条件で生産されるため、SigE過剰発現株を嫌気発酵条件で培養し、蓄積した水素の量をガスクロマトグラフィーで測定したところ、野生株に比べて水素の蓄積量が２倍に増加していることが明らかになった。

このことから、SigEというタンパク質は、バイオプラスチックPHB（ポリヒドロキシ酪酸）と水素の生産の両方を制御することが明らかになったのである。

バイオプラスチックPHBと水素は全然別のものに思えるが、両方とも還元力を利用して生産される。シネコシスティス細胞は、ある時にはPHBに還元力を割り振り、また別の時には水素に還元力を割り振るのである。このバランス調節がどのような場面で必要かはまだ明らかになっていない。しかし、視点を変えると、バイオプラスチックと水素生産が繋がっているということが明らかになり、興味深い結果となった。これはその後発表したコハク酸生産と水素生産の論文にも生かされている。

このように、バイオプラスチックに加え、水素の生産に関与する因子を発見したという論文であり、格式と伝統を有するThe Plant Journalにアクセプトされたことは非常に嬉しい出来事であった。コンスタントにこのレベルのジャーナルに出していきたいのだが、なかなか難しい。チャレンジあるのみである。

藻類バイオの領域公開シンポジウム 事後報告no.2

前回の続き、藻類バイオの領域公開シンポジウム 事後報告no.２である。

発表はさきがけの成果は簡単に紹介しただけで、その後の展開に焦点をおいて行った。

その後の展開は、本当にいろいろあった。激動すぎて正直なんか信じられない。大変ではあったけれど、よいこともたくさんあった。

大きな出来事の１つといえば、何と言っても明治大学に専任講師として着任したことである。農学部農芸化学科に環境バイオテクノロジー研究室を立ち上げることができた。それまでは理化学研究所にいたので、大学とは異なり教育ではなく研究が主目的であった（とはいえ、理化学研究所でも研究だけやっていればいいというわけではなく、広報的な仕事もいっぱいあった。その話はまたいつかどこかの機会で）。

明治大学では研究もさることながら教育に重点が置かれている。自分の名前で論文を発表していればいいわけではなく、学生にも研究発表・論文発表の機会を作らなければいけない。

ということで、各学生に対して個別のテーマを設定する必要がある。

現在ちょうど２０人（修士３名、学部生１７人）で、このくらい人数が増えたらどうなるのかと思っていたけれど、正直手が足りない。そして、学生たちが自分たちでテーマを作っていくようになったので、広がる一方になるのをむしろ止めないといけないくらいである。こんなことになるとは全く思っていなかった。嬉しい限りである。

そして、人ベースの研究計画とその成果をスライドで１枚ずつ発表していった。M1の学生が筆頭論文やポスター賞を取り、B4の学生まで論文を出しまくっているのには、さすがに驚いてくれたようであった。研究室みんなの努力の賜物である。

最後の章では、環境バイオテクノロジー研究室で本格的に始めた代謝酵素の生化学の結果を発表した。代謝といえば、前のグループはメタボロームの研究室だったし、代謝モデリングの先生と共同プロジェクトを進めている。

ところが、代謝酵素の生化学をやってみると、実は新しいことがどんどんわかり、最新の代謝研究に必須であることがわかってきた。そんな代謝酵素の生化学の重要性を訴えてきた。

夜は意見交換会。研究総括からアドバイザーの先生、CREST、さきがけのメンバー。本当にすごい人たちばかりである。情報の濃さがすごい。このメンバーに加われるだけで本当に光栄なのである。一回そういうメンバーに入ると、さらにそこから共同研究が生まれるし、すごく良い循環が生まれる。

そういう意味で、さきがけの研究総括・アドバイザーの先生方には本当に人生を変えていただいたと感謝している。領域会議はすごい大変だったけれど💦。

今年度で藻類バイオ領域のCREST・さきがけが終了なので本当に残念である・・・。ぜひとも後継プロジェクトが走って欲しいと、切に願っている。

藻類バイオの領域公開シンポジウム 事後報告no.1

「藻類・水圏微生物の機能解明と制御によるバイオエネルギー創成のための基盤技術の創出」（通称藻類バイオ）領域の研究成果報告会が11月30日に新宿NSビルにて開催された。http://www.jst.go.jp/presto/bioenergy/info/event_5.html

科学技術振興機構（通称JST）のCREST・さきがけのハイブリッド領域における研究成果を一般公開するものである。

会場は新宿NSビル。都庁のすぐ近くにある高層ビルである。都庁へは新宿駅から動く歩道で行けることで有名である。

こちらは都庁。周りの道は紅葉して綺麗な景色。新宿の高層ビル群の中で見事に整備された木々が並んでいる。

こちらがNSビルである。NSビルは、入り口がなんか難しい。この周辺は歩道が地下、１階、２階と多重に立体交差していて複雑である。帰りは暗くてなんと道に迷ってしまった💦

１時間と少し前についてしまったので、近くのスタバでしばしPCを立ち上げてメールチェックなどを行う。NSビルの会議室は残念ながらFree Wi-Fiが使えないので、ここで朝のお仕事をする。こういうときにカフェって欠かせない。

NSビルのエントランスには巨大なクリスマスツリーがあった。ライトアップもされていて、とても綺麗である。エネルギーを使いすぎなのではないかという疑問もあるけれど💦

ここはオフィスビルであるが、３０階に会議室がある。一般的にはあまり知られていないことだろう。NSビルは中央がすべて吹き抜けになっている。３０階から下を見下ろすとこんな感じ。

高い・・・中央が吹きふけで非常に贅沢な造りのビルになっている。

３０階からは新宿御苑や都庁もこのように見える。とてもよい眺めである。都庁の建物っておしゃれ。

都会の超高層ビル群の中に、意外に木々がたくさんあって驚くのが新宿の景色である。ちょうど綺麗に紅葉していた。

さて、発表はまず本年度終了となるCREST代表者４名が40分間ずつ行った。CRESTはチーム型研究なので３〜６つの大学や研究機関がチームを組んで研究を進めることになる。

さすがにCREST代表者の発表。レベルが違う。CREST代表者になるということはとても偉大なことで、一生に一度CREST代表者になれれば、それだけで研究者としてすごいことで、一流の研究者なのである。

ユーグレナから大型藻類、シアノバクテリアに紅藻シアニディオシゾン。基礎研究から応用研究に渡って幅広い結果を出している。さすがに最終成果報告会であり、すごい結果が目白押しである。自分も頑張らないとなあとため息がでる。。

次のセッションはさきがけが終了した２名。最初が私の番。研究内容だけでなく、明治大学での環境バイオテクノロジー研究室立ち上げの話や研究室での運営方針などの話をした。

タイトルの写真は研究室から見える景色。朝焼けのように見える夕焼けである。最近こういう画像に凝っているので、さっそくプレゼンテーションでも使ってみた。

２枚目のスライドは、このあいだの生明祭で撮ったフレンチトーストの写真。いや、さきがけ研究と何も関係ないのだけど。。写真はともかく、タイトルスライドは入れた方が発表はわかりやすいと思う。

no. 2に続く。

RNAポリメラーゼシグマ因子とは？

大学院生のころから研究しているのが、RNAポリメラーゼシグマ因子というタンパク質である。

RNAポリメラーゼは、分子生物学の授業で大学生は必ず習うタンパク質である。

一部のウイルスを除くすべての生物は、DNA（デオキシリボ核酸）を遺伝子としている。DNAの４つの塩基（GATC）に生命の情報が記載されているのである。

遺伝子はDNAから構成されているが、生命の設計図たるDNAを毎回細胞内のいろいろなところに持っていくわけにはいかない。細胞は、DNAを一旦コピーして、使う場所に持っていくのである。

DNAの情報は、RNA（リボ核酸）という物質にコピーされる。このRNAを合成するプロセスを転写（transcription）と呼ぶ。日本語の転写はコピーに写し取るという意味でも使われるが、とてもわかりやすい日本語になっている。

このDNAからRNAに転写する際に、必要な酵素（タンパク質）がRNAポリメラーゼである。ということで、すべての生物にとって、RNAポリメラーゼは必須のタンパク質である。

RNAポリメラーゼは、原核生物と真核生物で構成が異なる。真核生物はシングルサブユニット型、原核生物はマルチサブユニット型である。シングルサブユニット型とは何かというと１つのタンパク質から構成されており、マルチサブユニット型は複数のタンパク質から構成されているということである。

真核生物の場合は、１つのサブユニットからなるが、たくさんの基本転写因子というタンパク質群が転写には必要になる。この基本転写因子がたくさんあるため、「転写って複雑で難しい！」という印象を与えることがある（私もぜんぜん覚えていないので、必要な時に教科書を見れば十分だと思う。。）。

原核生物の場合は、RNAポリメラーゼは複数のタンパク質からなる。RNAの合成を行うタンパク質は、コア酵素と呼ばれ、α、β、β'、ωの４種類からなる。ωは必須ではないので３種類と書いてある場合も多い。このコア酵素にσ因子（シグマ因子）が結合して、RNAポリメラーゼが完成する。すべてのタンパク質を合わせてホロ酵素と呼ぶ。

シグマ因子の役割は、RNAポリメラーゼとDNAを結合させることである。DNAから情報を読み取り、RNAを合成するので、当然ながらRNAポリメラーゼがDNAに結合する必要がある。この役割を担うのがシグマ因子である。RNAポリメラーゼが結合する部分のDNAをプロモーターと呼ぶ。

そして、RNAポリメラーゼがDNAに結合したのち、転写が開始する。この転写を開始させるのもシグマ因子の役割である。転写開始後は、シグマ因子は外れて、コア酵素だけで進んでいき、RNAが合成されていく。

シグマ因子は１つだけではなく、細胞の中には複数のシグマ因子があるのが一般的である。細菌の遺伝子は、一般的に数千の単位で存在する。どの遺伝子をどのくらい転写するかを決定するのに、シグマ因子が重要なのである。

環境バイオテクノロジー研究室では、光合成原核生物であるシアノバクテリアのSigEというシグマ因子を改変することで遺伝子の転写を改変し、それによってポリヒドロキシ酪酸やコハク酸というプラスチック原料の増産を行っている。